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本文標(biāo)題："實(shí)驗(yàn)步驟-免疫細(xì)胞化學(xué)染色法之單一染色"
新聞來(lái)源：未知 發(fā)布時(shí)間：2012-11-12 16:47:18 本站主頁(yè)地址：http://m.f0211.cn
實(shí)驗(yàn)步驟-免疫細(xì)胞化學(xué)染色法之單一染色
免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 ( immunocytochemistry)
單一染色
利用單一免疫細(xì)胞化學(xué)染色法（immumocytochemical staining）可鑒定本實(shí)驗(yàn)
培養(yǎng)之混合神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的型態(tài)、種類及組成比例。以 anti-glial fibrillary acidic
protein（anti-GFAP）辨示星狀膠質(zhì)細(xì)胞（asatrocytes），由于星狀膠質(zhì)細(xì)胞含有豐
富的 glial fibrillary acidic protein 故被染上的星狀膠質(zhì)細(xì)胞，在顯微鏡下可看到一
絲一絲的 glial fibrillary acidic protein。而用于辨示微小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia）的有
anti-ED1、anti-OX6、anti-OX42；anti-ED1 可辨示微小膠細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的溶小體
（lysosome）一般而言，anti-ED1 可標(biāo)示的是活化態(tài)的微小膠質(zhì)細(xì)胞，但離體實(shí)
驗(yàn)（in vitro）對(duì)微小膠質(zhì)細(xì)胞而言，就會(huì)稍微使得微小膠質(zhì)細(xì)胞被活化但其活化
的程度與給 LPS 處理后相較仍有程度上之差異；從 anti-ED1 染色可看到給予 LPS
處理的微小膠質(zhì)細(xì)胞其外形變得比較圓、幾乎看不到突起的觸角（process）而無(wú)
給予 LPS 處理的微小膠質(zhì)細(xì)胞亦可被標(biāo)示到，但顯微鏡下可看到其外形較細(xì)長(zhǎng)、
仍可清楚看到突起的觸角。anti-OX6 辨示活化狀態(tài)之微小膠細(xì)胞細(xì)胞膜上 MHC
class II 的接受器。而 anti-OX42 可辨示微小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞膜上 CR III 接受器，不
論微小膠質(zhì)細(xì)胞是否被活化都可被 anti-OX42 標(biāo)示到。當(dāng)微小膠質(zhì)細(xì)胞被活化
時(shí)，其型態(tài)會(huì)由靜止?fàn)顟B(tài)（resting stage）變成活化狀態(tài)（activated stage），即細(xì)胞
的外觀會(huì)由不規(guī)則的、細(xì)長(zhǎng)的外形且可看到突起的觸角慢慢轉(zhuǎn)變?yōu)橥庑屋^圓、突
起的觸角逐漸縮短的型態(tài)，稱為（amoeboid）
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 將細(xì)胞種于置有玻片的 24 孔培養(yǎng)盤中，定期更換新鮮培養(yǎng)液至可實(shí)驗(yàn)狀態(tài)。
藥物處理后的細(xì)胞以 PBS（1X、pH＝7.4）清洗二次（10 分鐘 / 次）后，加
入 4% paraformaldehyde 置于室溫下二十分鐘以固定細(xì)胞，之后移除
paraformaldehyde 再以 0.05M TBS（pH=7.6）清洗細(xì)胞。
2. 加入 3% H2O2 于 0.05M TBS，置室溫下作用三十分鐘以去除內(nèi)生性過(guò)氧化酵素
（endogenous peroxidase）。
3. 以 0.05M TBS 清洗細(xì)胞三次，移除 H2O2，盡可能避免泡泡產(chǎn)生。
4. 去除非特異性的結(jié)合（nonspecific binding），將 10% normal horse serum（NHS）
或 normal goat serum（NGS）,0.1% Triton X-100 加至 0.05M TBS 混合后，加入
24 孔培養(yǎng)盤中使之足以覆蓋表面，置室溫下一小時(shí)。
5. 移除 NHS 或 NGS，以 0.05M TBS 清洗細(xì)胞三次后，加入初級(jí)抗體置于 4℃過(guò)
夜反應(yīng)。
6. 移除初級(jí)抗體，以 0.05M TBS 清洗細(xì)胞三次后，加入次級(jí)抗體于室溫下反應(yīng)
一小時(shí)。
7. 移除次級(jí)抗體，以 0.05M TBS 清洗細(xì)胞三次后，加入 peroxidase-conjugated
streptavidin 于室溫下反應(yīng)三十分鐘。
8. 移除 peroxidase-conjugated streptavidin，以 0.05M TBS 清洗細(xì)胞三次后，加入
DAB（5% DAB+1% H2O2）作呈色反應(yīng)
9. 對(duì)比染色
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